产品货号:
GS0065
中文名称:
柱式动物基因组DNA提取试剂盒
英文名称:
Czup Column Animal gDNA Purification Kit
产品规格:
50次|100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是我司最新研制成功的一种动物基因组DNA提取试剂盒。本制品对经典的SDS裂解液进行了改良,并使用高浓度的蛋白变性剂,大大提高了裂解的效率,缩短了裂解的时间。无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂。从25mg动物组织可以获得8~15μg DNA,OD260/OD280比值一般为1.7~1.9。
本试剂盒适用广泛,亦可用于动物组织、细胞、福尔马林固定组织等样品的基因组DNA提取。提取出的DNA可用于酶切、PCR、Southern blot等相关实验。
组分 | 50次 | 100次 |
Buffer ACL | 10mL | 20mL |
Buffer CL | 12mL | 24mL |
CW1 Solution (concentrate) | 13mL | 26mL |
CW2 Solution (concentrate) | 9mL | 18mL |
CE Buffer (pH9.0) | 15mL | 30mL |
Proteinase K | 1.2mL | 2.4mL |
吸附柱及收集管 | 50套 | 100套 |
保存:室温,4℃可保存时间更长。
- 该试剂盒中提供的Proteinase K溶液为特别优化的配方,方便使用,而且非常稳定,可以在室温保存半年以上而活性不受明显影响,如需进一步延长保存期限,请置4℃保存。
- Buffer ACL和Buffer CL中含有刺激性的化合物,操作过程中应穿上实验服,戴好乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后,请立即用清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医生的帮助。
一、组织细胞DNA提取
- 准备工作:
- 自备材料:水浴锅、小型高速离心机(最大离心力≥ 12000×g)、1.5mL离心管、无水乙醇、RNase A (10mg/mL)等。
- 试剂盒初次开启,按瓶身标签说明在CW1 Solution、CW2 Solution中加入相应量的无水乙醇混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。(13mL CW1 Solution加17mL无水乙醇,9mL CW2 Solution加21mL无水乙醇;26mL CW1 Solution应加入34mL无水乙醇,18mL CW2 Solution应加入42mL无水乙醇。)
- 每次使用前请检查Buffer ACL和Buffer CL是否出现沉淀,如有沉淀,请于56℃溶解后使用。
- 自备材料:水浴锅、小型高速离心机(最大离心力≥ 12000×g)、1.5mL离心管、无水乙醇、RNase A (10mg/mL)等。
- 操作步骤
- 样品处理
- 动物组织:取约25mg动物组织用液氮研磨成粉末加到1.5mL离心管中,加入180μL Buffer ACL,再加入20μL
Proteinase K溶液,震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。- 通常动物组织完全裂解需要1~3h,取样过多会影响提取DNA的质量(动物组织取样量应≤ 25mg,动物脾脏取样量应≤ 10mg,小鼠尾巴最大用量为1.2cm长片段,大鼠鼠尾巴最大用量为0.6cm长片段,并将裂解时间延长至6~8h)。
- 水浴过程中,每10min颠倒混匀一次,可促进细胞裂解。
- 如需得到无RNA的DNA,可在水浴后加入20μL RNase A(10mg/mL),室温放置2~5min。
- 通常动物组织完全裂解需要1~3h,取样过多会影响提取DNA的质量(动物组织取样量应≤ 25mg,动物脾脏取样量应≤ 10mg,小鼠尾巴最大用量为1.2cm长片段,大鼠鼠尾巴最大用量为0.6cm长片段,并将裂解时间延长至6~8h)。
- 贴壁培养细胞:弃尽培养液,每10cm2细胞加入200μL Buffer PBS和20μL Proteinase K,轻轻晃动培养瓶,收集细胞转移至新的离心管中,再加入200μL Buffer CL,震荡混匀,56℃水浴10min,继续进行抽提步骤中3~8步骤。
- Buffer PBS需自备(150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2)
- 水浴过程中,每3min颠倒混匀一次,可促进细胞裂解。
- 如需得到无RNA的DNA,可在水浴后加入20μL RNase A(10mg/mL),室温放置2~5min。
- Buffer PBS需自备(150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2)
- 悬浮培养细胞:收集5×106细胞,离心去除培养液,加入200μL Buffer PBS和20μL Proteinase K,混匀。再加入200μL Buffer CL,震荡混匀,56℃水浴10min,继续进行抽提步骤中3~8步骤。
- Buffer PBS需自备(150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2)
- 水浴过程中,每3min颠倒混匀一次,可促进细胞裂解。
- 如需得到无RNA的DNA,可在水浴后加入20μL RNase A(10mg/mL),室温放置2~5min。
- Buffer PBS需自备(150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2)
- 动物组织:取约25mg动物组织用液氮研磨成粉末加到1.5mL离心管中,加入180μL Buffer ACL,再加入20μL
- 加入200μL Buffer CL,充分颠倒混匀。
- 加入Buffer CL后,如有沉淀产生,可70℃水浴10min。
- 加入200μL的无水乙醇,充分颠倒混匀。
- 加入无水乙醇后可能会产生半透明纤维状悬浮物,不影响DNA的提取和应用。
- 将吸附柱放入收集管中,用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中,静置2min,再10000rpm室温离心1min,倒掉收集管中废液。
- 将吸附柱放回收集管中,向吸附柱中加入500μL CW1 Solution,10000rpm离心30 s,倒掉收集管废液。
- 使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。
- 将吸附柱放回收集管中,向吸附柱中加入500μL CW2 Solution,10000rpm离心30 s,倒掉收集管废液。
- 使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。
- 将吸附柱重新放回收集管中,于12000rpm室温离心2min,离去残留的CW2 Solution。
- 将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution,CW2 Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
- 取出吸附柱,放入一个新的1.5mL离心管中,加入50~200μL CE Buffer静置3min,12000rpm室温离心2min,收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
- 如果想提高DNA的得率,可重复步骤8。
- 样品处理
二、福尔马林固定组织DNA提取
- 准备工作:
- 自备试剂:PBS Solution(150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2)、无水乙醇、RNase A(20mg/mL)等。
- 从福尔马林固定组织中获得的基因DNA完整性与样品保存时间相关,样品保存时间越长,获得的基因DNA就越不完整。此类样品保存时间一般都比较长,获得的DNA通常小于650bp。
- 加入Buffer ACL后,56℃水浴至细胞完全裂解,通常动物组织完全裂解需要1~3小时。可根据样品的差别适当延长56℃水浴水浴时间,至细胞完全裂解。
- 样品固定剂建议选用乙醇或福尔马林,有交联作用的固定剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于基因组DNA提取。
- 自备试剂:PBS Solution(150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2)、无水乙醇、RNase A(20mg/mL)等。
- 标准抽提步骤
- 取10~25mg福尔马林固定组织,放入1.5mL离心管中。
- 取样时尽量取中间部分,因为福尔马林对DNA有一定的破坏作用。
- 用PBS溶液漂洗两次,去除组织表面残留的福尔马林溶液
- 加入180μL Buffer ACL,再加入20μL Proteinase K溶液,震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。
- 通常动物组织完全裂解需要1~3小时,如果裂解不完全可适当延长水浴时间。
- 如需得到无RNA的DNA,可在水浴后加入20μL的RNase A(20mg/mL),室温放置2~5分钟。
- 通常动物组织完全裂解需要1~3小时,如果裂解不完全可适当延长水浴时间。
- 继续进行标准抽提步骤中2~8步骤。
- 福尔马林会使固定的样品基因组DNA发生断裂,获得的DNA通常小于650bp。
- 取10~25mg福尔马林固定组织,放入1.5mL离心管中。
- 未获得DNA
- 使用的样品量过少,以至于凝胶电泳或吸光度测定无法检测,可适当增加样品用量。
- 对于快速抽提方法而言,用75%乙醇漂洗,倒掉残夜时需要防止沉淀随之丢失。沉淀量较少时,用75%乙醇漂洗后应12000rpm离心2min,小心吸去上清,避免沉淀丢失。
- 对于柱式抽提方法而言,漂洗液CW1 Solution、CW2 Solution初次使用请按瓶身标签说明加入相应量的无水乙醇。否则,DNA将在漂洗过程中流失。
- 使用的样品量过少,以至于凝胶电泳或吸光度测定无法检测,可适当增加样品用量。
- 获得的沉淀无法全部溶解
- 使用的样品量过多,可适当减少样品用量。
- 动物组织等材料富含糖原,加入8mM NaOH充分溶解后有不溶物是正常现象,应12000rpm离心2min,取上清。一般不影响后续实验。
- 使用的样品量过多,可适当减少样品用量。
- 获得的DNA浓度很低
- 使用的样品量过少,可适当增加样品用量。
- 样品研磨不充分,取样后应将样品充分研磨,使样品和裂解液充分接触,确保样品完全裂解。
- 没有选择合适的洗脱液或没有按照洗脱说明操作,需按严格按说明书洗脱DNA。
- 使用的样品量过少,可适当增加样品用量。
- 获得DNA断裂、降解
- 样品没有按要求冷冻保存,建议使用新鲜样品用液氮进行研磨,样品如果因为某些原因必须先行保存,可以将样品保存于-70℃冰箱。
- 样品反复冻融,需要保存的样品应分割后保存于-70℃冰箱,避免反复冻融,以确保样品的DNA未降解。
- 样品研磨不充分,用液氮研磨样品时,应注意研磨充分,加入裂解液后充分混匀。
- 提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断,应严格按说明书操作。
- 样品没有按要求冷冻保存,建议使用新鲜样品用液氮进行研磨,样品如果因为某些原因必须先行保存,可以将样品保存于-70℃冰箱。
- 过柱离心吸附柱有时会堵塞
- 样品裂解时间过短,样品裂解不完全导致,应适当延长裂解时间至裂解液澄清。
- 加入Buffer CL后,如有沉淀产生,应70℃水浴10分钟至澄清。
- 样品使用量过大,应减少样品用量,取样不要超过说明书上的最大样品用量。
- 样品裂解时间过短,样品裂解不完全导致,应适当延长裂解时间至裂解液澄清。
- DNA样品不纯,抑制或干扰后续实验反应
- 漂洗液75%乙醇有残留,由于用户使用的离心管质量不同,残液会有不同程度的挂壁现象,所以可以倒掉液体后短暂高速离心,用移液器吸去残液。
- 75%乙醇漂洗不充分,漂洗时应将沉淀悬浮起来,尤其是当核酸沉淀较大时,以确保去除盐等小分子杂质。
- DNA在洗脱前,有漂洗液残留,抑制后续酶解和PCR反应。加入洗脱液前,吸附柱应打开盖子于室温放置5~10分钟,以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution。
- 漂洗液75%乙醇有残留,由于用户使用的离心管质量不同,残液会有不同程度的挂壁现象,所以可以倒掉液体后短暂高速离心,用移液器吸去残液。
- 利用琼脂糖凝胶电泳检验DNA时,加样孔非常亮
- 大片段的基因组DNA由于难以电泳出加样孔,会使加样孔非常的亮。
- 使用的琼脂糖凝胶浓度过高,建议使用0.7﹪的琼脂糖凝胶进行电泳。
- 获得的DNA中含有蛋白等杂质,建议适当减少样品用量。
- 大片段的基因组DNA由于难以电泳出加样孔,会使加样孔非常的亮。
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